Pela Bula Pro Excellenti Apostolicae Sedis, com data de 21 de Agosto de 1549, o Papa Paulo III criou a diocese de Portalegre, cujo território foi desmembrado da diocese da Guarda (Egitânia), integrando as povoações a Sul do Tejo, com excepção de Arronches, que continuou a pertencer ao mosteiro de Santa Cruz de Coimbra. Pelo mesmo documento lhe foi dado o seu primeiro bispo, D. Julião d'Alva.
A dita Bula teria a sua execução prática em dois de Abril do ano seguinte. Três freguesias de então foram extintas (Santa Maria do Castelo, S. Vivente e Santa Maria Maior) para dar lugar à freguesia de Nossa Senhora da Assunção da Sé.
Criada a diocese, D. João III eleva a cidade a então vila de Portalegre, por carta régia de 23 de Maio de 1550.
D. Julião d’Alva criou o Cabido da Sé em 1556, o qual se compõe de 11 Cónegos Capitulares. Os seus Estatutos datam de 25 de Julho de 1559, e o seu Regimento é de 01 de Maio de 1560. A Catedral foi erguida no espaço que então rodeava a igreja de Santa Maria do Castelo: a primeira pedra foi lançada no dia 14 de Maio de 1556. Uma vez que não constava da sua Dedicação, D. Domingos Maria Frutuoso (1921-1949), procedeu a este Rito Litúrgico, no dia 6 de Maio de 1926, facto atestado por lápide memorial na sua Capela-mor.
Até hoje, a Diocese pastoralmente governada por trinta Bispos, ajudados especialmente pelo Cabido da Sé e por incontáveis Presbíteros. Nos vários períodos Sede Vacante, o seu governo foi entregue a Vigários Capitulares (1833-1844) e a Vigários Gerais, nomeados pelo Patriarca de Lisboa, na sua qualidade de Administrador da Diocese de Portalegre (1844-1884).
A criação da diocese de Castelo Branco data de sete de Junho de 1771, sob o pontificado de Clemente XIV, que, pelo mesmo documento, indicou para Catedral a igreja de S. Miguel Arcanjo, eximindo-a à jurisdição da Ordem de Cristo. Dada a vastidão do território da diocese da Guarda, a diocese de Castelo Branco é criada com o parecer de D. Bernardo António de Melo Osório, último bispo da Guarda com jurisdição em Castelo Branco. A nova diocese integrava os arcediagados de Castelo Branco, Monsanto e Abrantes.
Por sua vez, o rei D. José elevou a notável vila a cidade, por alvará de 20 de Março e carta régia de 15 de Abril do mesmo ano.
Foi seu primeiro bispo, D. Frei José de Jesus Maria Caetano (1772-1782). Sucedeu-lhe D. Frei Vicente Ferrer da Rocha, também dominicano (1783-1814). O terceiro e último bispo de Castelo Branco foi D. Joaquim José de Miranda Coutinho (1820-1831). De 1814 a 1820, e a partir de 1831 até à sua extinção, foi governada apenas por Vigários Gerais. A sua extinção foi determinada por carta apostólica de 30 de Setembro de 1881, sob o pontificado de Leão XIII, e pelo decreto régio de 14 de Setembro de 1882, sob o pretexto de dificuldades económicas.
Consumada a extinção, pela carta apostólica Gravissimum Christi Ecclesiam, o seu território foi incorporado no da diocese de Portalegre. A nova diocese passou a contar com 12 arciprestados, integrando 148 paróquias.
D. Agostinho Joaquim Lopes de Moura, 27º bispo de Portalegre, "para promover mais eficazmente o bem das almas, pediu à Sé apostólica seja elevado à dignidade de Catedral o templo que existe na referida cidade a Deus dedicado, em honra de S. Miguel Arcanjo", o que foi consentido por decreto da Sagrada Congregação Consistorial, datado de 18 de Julho de 1956. E acrescenta o dito decreto: "Por isso, o Santo Padre impõe ao bispo de Portalegre o ónus, sobretudo a partir da construção da conveniente casa episcopal, de residir algum tempo em cada ano, em Castelo Branco. Sua Santidade concede que, acrescentado o nome de Castelo Branco, a Diocese e o seu bispo, agora e para o futuro, possam designar-se e de facto se designem de Portalegre e de Castelo Branco."
É Padroeiro principal da diocese de Portalegre-Castelo Branco Santo António de Lisboa, conforme determinação do papa Leão XIII, em 11 de Maio de 1896.
Desde 2008 é seu bispo, D. Antonino Eugénio Fernandes Dias. Conta actualmente com 161 paróquias, agrupadas em cinco arciprestados: Abrantes (33), Castelo Branco (44), Ponte de Sor (27), Portalegre (22) e Sertã (35). Presbíteros activos diocesanos são 50, três dos quais a trabalhar fora da Diocese, e ainda 13 Religiosos. Conta também com 13 Diáconos Permanentes, e Religiosas de vários Institutos de vida consagrada.